Сбор, доставка и хранение инфекционного материала для прижизненной диагностики бешенства


Тема: методы лабораторной экспресс-диагностики бешенства.


СБОР, ДОСТАВКА И ХРАНЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА

1. Материал для прижизненной диагностики

В качестве материала для прижизненной диагностики бешенства можно использовать выделения и биологические жидкости, а также ткани больных людей и животных, в т. ч.:

1.1. Для выявления антигена:

  • отпечатки роговицы глаза больного человека или животного;
  • буккальный эпителий;
  • луковицы волос;
  • биоптаты тканей.

1.2. Для выявления РНК-вируса:

  • биоптаты тканей;
  • слезную жидкость;
  • слюну;
  • спинномозговую жидкость (СМЖ).

1.3. Для выделения вируса:

  • слюну больного человека или животного;
  • слезную жидкость;
  • СМЖ на ранних стадиях заболевания.

1.4. Для выявления антител:

  • СМЖ на поздних стадиях заболевания;
  • сыворотку крови.

2. Сбор и хранение инфекционного материала

2.1. Слезная жидкость. Забор осуществляют в одноразовые стерильные пробирки объемом 1,5 мл. Для усиления слезоотделения проводится провокация слезоточивым веществом (обычно используется нашатырный спирт). Предобработка проб не требуется.

Условия хранения материала до момента исследования:

  • при температуре +2–8° С - в течение 6 часов;
  • при температуре –20° С - в течение 1 недели;
  • при температуре минус 70° С - длительно.

Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.

2.2. Защечный (буккальный) эпителий. Защечный эпителий - это верхний слой живых клеток, которые очень удобны для исследования на бешенство. Клетки легко отделяются, достаточно крупные, с овальными ядрами, которые обычно занимают центральное положение. Если такие клетки перенести в пробирку с физиологическим раствором (с добавлением 5–10% эмбриональной сыворотки теленка), они долго остаются жизнеспособными, к тому же хорошо видны при увеличении в 400 и даже в 200 раз.

Забор буккального эпителия исключает прием пищи в течение 4-х часов. Перед забором производится тщательное полоскание полости рта водой или физиологическим раствором. Забор эпителия производится соскобом клеток с внутренней стороны щеки тупым стерильным шпателем, пластиковой кисточкой, разовым зондом с синтетическим ворсом. Соскоб со шпателя аккуратно смывается физиологическим раствором в стерильную одноразовую пробирку типа «Эппендорф» (0,5–3 мл) с транспортной средой (физиологический раствор). При использовании зонда с синтетическим ворсом в пробирку помещается отрезанная рабочая часть зонда. Забор буккального эпителия может производиться самостоятельно обследуемым, процедура совершенно безболезненна, бескровна и не травматична.

Материал в пробирки необходимо отбирать по возможности свежий, до доставки в лабораторию материал хранят при –20° C не более 7 дней, транспортировка осуществляется в термосе со льдом.

2.3. Роговичные отпечатки. Отпечатки роговицы глаза берут на тщательно обезжиренные в смеси спирт – эфир (1:1) стерильные предметные стекла шириной 10–12 мм, что обеспечивает хороший доступ к роговице.

Взятие отпечатков роговицы у человека должно производиться врачом, а у животных – ветеринаром или фельдшером с соблюдением мер личной безопасности (особенно при необычном поведении животного). Для этого в целях безопасности на руки надевают резиновые перчатки, лицо от защищают марлевой повязкой и очками или плексигласовым щитком. Собак и кошек во избежание нанесения ими укусов или царапин надежно фиксируют, собаки должны быть в намордниках. Животных, которые ведут себя беспокойно, можно временно обездвижить (наркоз).

Отпечатки фиксируют охлажденным ацетоном, препараты высушивают на воздухе в течение 4-х часов при температуре +4° С или путем 5–8-кратной проводки над пламенем горелки. Перед окраской отпечатков диагностическим антирабическим иммуноглобулином их контуры очерчивают карандашом по стеклу с обратной стороны.

Условия хранения: при комнатной температуре или в условиях холодильника (+2–8° С) — в течение 6 часов.

2.4. Слюна. Взятие слюны осуществляется в одноразовые стерильные пробирки типа «Эппендорф» на 1,5 мл в количестве 0,2-1,0 мл. За 12 часов до сбора слюны исключают прием алкоголя. Непосредственно перед сбором необходимо исключить использование зубной пасты и удалить зубные протезы. Производится трехкратное полоскание полости рта физиологическим раствором и вновь образовавшаяся слюна отсасывается со дна ротовой полости одноразовым шприцем и переносится в одноразовые стерильные сухие флаконы или выплевывается в них. Предобработка проб не требуется. Транспортировку клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом.

Условия хранения: при температуре +2–8° С — в течение 6 часов; в замороженном виде — до момента исследования. Не рекомендуется размораживание более одного раза.

2.5. Луковицы волос. При взятии проб волосы и поверхность кожи в зоне шеи обрабатывают спиртом, после чего проводится аккуратное выдергивание волос. Необходимо следить, чтобы на концах взятых волос оставались волосяные луковицы, потому что именно они используются для анализа. Необходимо выдернуть не менее 3–4 волос с луковицами.

Условия хранения: при комнатной температуре — в течение 6 часов; при температуре 2–8° С — длительное время, но обязательно в сухом и темном месте. Свет разрушает цепочки ДНК, поэтому при отправке по почте конверты с образцами волос нужно упаковывать в плотную бумагу или пакет. Не следует использовать для взятия и хранения проб полиэтиленовые пакеты, в которых обычно скапливается влага, и могут поселяться бактерии и грибки.

2.6. Спинномозговая жидкость. Ликвор получают путем прокола поясничной субокципитальной области или мозговых желудочков одноразовыми пункционными иглами. Забор ликвора в количестве не менее 0,5–1 мл проводят в одноразовые пластиковые пробирки объемом 1,5 мл. Предобработка проб не требуется.

Условия хранения: при –20° С.

2.7. Кровь. Забор крови для ПЦР-диагностики. Использование цельной крови и плазмы допустимо для проведения качественных и количественных исследований, использование сыворотки крови — только для проведения качественных исследований методом ПЦР.

Для получения плазмы забор крови производят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8–1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа «Venoject» (с 6% ЭДТА).

При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую пластиковую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом).

Для получения сыворотки забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8–1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 3–5 мл или специальную вакуумную систему типа «Venoject» без антикоагулянта. При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку.

Предобработка проб. Плазму крови получают центрифугированием пробирок с цельной кровью при 800–1600g (3 тыс. об./мин) в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем отбирают плазму в количестве не менее 1 мл отдельными наконечниками с аэрозольным барьером в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре до полного образования сгустка. Затем центрифугируют при 3 тыс. об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Переносят сыворотку в количестве не менее 1 мл отдельными наконечниками с аэрозольным барьером в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

Условия хранения: образцы цельной крови хранят при температуре 2–5° С. Пробы крови хранят и транспортируют при низких положительных температурах в течение 3-х суток с момента взятия. Сыворотки крови хранят в заморозке (–20° С).

2.8. Биоптаты (микробиоптаты). При инвазивных вмешательствах или при обработке глубоких и обширных укушенных ран для обнаружения рабического вируса или его антигена можно использовать биоптаты органов. Забор микробиоптата (пунктата) производит врач биопсийными щипцами, изымая от каждого органа или укушенной раны 1–2 кусочка ткани или поврежденной кожи размерами от 1 мм3 до 1 см3. Материал после взятия помещают в пробирки объемом 1,5 мл с транспортной средой, закрывают пробкой, маркируют и тщательно упаковывают.

Предобработка проб не требуется.

Образцы пунктатов, предназначенные для выделения РНК, хранят при температуре 2–8° С. При отправке материала в вирусологическую лабораторию принимают меры предосторожности, чтобы не разбить стеклянную посуду. Кусочки необходимо в течение первых суток после изъятия передать в лабораторию. Если такой возможности нет, их сохраняют в холодильнике не более 36 часов до передачи в лабораторию. Максимальный срок хранения — 14 дней при +4° С.

2.9. Сроки забора материала. При любом выбранном подходе к ранней диагностике бешенства одним из важнейших факторов является качество исследуемого материала. Так, например, для прямого анализа образца или для изоляции вируса исследуемый материал должен быть получен в самом начале заболевания, когда возбудитель еще экскретируется в относительно больших количествах и не связан пока антителами, а объем образца должен быть достаточен для проведения прямого исследования. При исследовании биоптата заднего отдела шеи нужно следить, чтобы в образце содержались неповрежденные луковицы волос (волосы не должны быть сострижены), при этом минимальное количество волос должно быть не менее 3. Следует учитывать, что локальное повышение температуры в клетках луковицы приводит к их разрушению.

Не последнюю роль в успешной диагностике играет среда, в которую берется материал, как он транспортируется и хранится. Так, если планируется изоляция вируса, инфекционный материал должен быть помещен в среду, содержащую белок, который предотвращает быструю потерю инфекциозности вируса. Если планируется работа с нуклеиновыми кислотами, материал следует помещать в соответствующий буфер. Обычно исследуемый материал помещают в стерильную посуду со стабилизирующей средой, которая состоит из буферного раствора с нейтральным рН, белка и антибиотиков, и по возможности быстро доставляют в вирусологическую лабораторию в контейнере со льдом.

В лаборатории забранный для исследования материал надо сохранять в холодильнике или на льду вплоть до исследования. Однократное замораживание не влияет на результаты исследования, в то время как многократное замораживание и оттаивание снижают диагностическую ценность материала.

Далее: экспресс-диагностика бешенства.

Наш сайт трудно найти в Яндексе, рекомендуем добавить его в закладки: